ملاحظاتی درباره طول عمر ستون های HPLC

 

اگر چه ستون های HPLC از خود دستگاه ارزان تر هستند اما قطعا جزو پر هزینه ترین قطعه مصرفی دستگاه می‌باشند .

در این مقاله سعی شده است  نحوه نگهداری از آن ها و افزایش طول عمرشان مورد بررسی قرار بگیرد و به برخی از سوالات بپردازیم

 

تا به حال این سوال برایتان پیش آمده که طول عمر ستون های HPLC به چه عواملی بستگی دارد؟

همیشه این پرسش از سوی کاربران دستگاه های HPLC مطرح بوده است که طول عمر یک ستون HPLC چقدر است. خیلی از کاربران تعداد متوسط هزار تزریق به یک ستون را عمر قابل قبولی برای آن می‌دانند اما واقعیت این است که عمر ستون (اگرچه کیفیت آن از یک سازنده به سازنده دیگر متفاوت است)، بیشتر به شرایط آنالیز مانند ترکیب و pH فاز متحرک، غلظت بافر مورد استفاده، وضعیت نمونه مورد آنالیز و نحوه مراقبت و رفتار ما با ستون بستگی دارد. 

 

 

به عنوان مثال شکل 2-1 تزریق ده هزار نمونه را بر روی ستون Symmetry C8 شرکت واترز نشان می‌دهد. اما همانطور که از شکل مشخص است ، فاز متحرک سیستم بسیار ساده ای دارد و دمای کار فقط 25 درجه سانتی‌گراد است ! 

 

 

 

آیا از این شکل می‌توان نتیجه گیری کرد که تمامی ستون ها دارای طول عمر طولانی هستند ؟ جواب قطعا منفی است . تنها نتیجه ای که می‌توان از این شکل گرفت این است که این ستون تحت شرایط ذکر شده در روش آنالیز و آن نمونه مشخص شده در شکل دارای طول عمر بسیار زیادی است. یعنی شرایط آنالیز نقشی تعیین کننده در طول عمر ستون دارد. چرا که یک نفر ممکن است با تعداد 200 تزریق به یک ستون راضی بوده و فرد دیگری بتواند ده هزار نمونه را به همان ستون تزریق کند. حال اگر بخواهیم حالت های مختلفی را بررسی کنیم که ممکن است برای یک کاربر پیش بیاید برای زمانی که همیشه ستون 200 تزریق عمر میکرده است 

دو حالت را می‌توان متصور شد : 

در حالت اول فرض می‌کنیم  که با توجه به شرایط آنالیز 200 تزریق عدد مناسبی برای طول عمر ستون ماست. حالا اگر با تعویض ستون و نصب یک ستون جدید نتوانیم همان تعداد را تزریق کنیم و ستون ما خراب شود ، باید به دنبال دلیل آن بگردیم. در این حالت اگر مطمئن باشیم که هیچ یک از شرایط آنالیز مثل ترکیبات و pH فاز متحرک ، دمای ستون و به ویژه نحوه آماده سازی نمونه تغییری نکرده باشد باید علت را در ضعف مکانیکی بستر کروماتوگرافی بررسی کرد . این ضعف می‌تواند ناشی از نقص کیفیت در تولید ستون و یا تنش های مکانیکی وارده به آن در زمان حمل و نقل ستون باشد ( به عنوان مثال ستون از دست کاربر به زمین افتاده باشد ). این امر را باید یک استثنا تلقی نمود و ستون باید تعویض گردد. 

در حالت دوم ، اگر فرض کنیم که تعداد 200 تزریق برای ستون طول عمر مناسبی نیست و باید در روش آنالیز خود به ویژه در نحوه‌ی آماده سازی نمونه تجدید نظر کنیم و یا روش های محافظت بیشتری برای ستون در نظر بگیریم. همانطور که می‌دانیم ، بعضی نمونه ها به دلیل حلالیت پایین ، روی فاز ساکن یا قسمت ابتدایی ستون رسوب می‌کنند که با هر بار تزریق این‌کار موجب تجمع این مواد  در ستون شده و بعد از مدتی موجب خرابی آن می‌گردد. 

 راهکار چیست؟ 

راه های مختلفی برای کاهش این امر و افزایش طول عمر ستون وجود دارد. مثلا یکی از این راه ها ، می‌تواند پاکسازی بهتر نمونه قبل از تزریق به ستون با روش تکنیک هایی مانند SPE ( Solid phase extraction) باشد. اما قطعا بهترین روش استفاده از پیش ستون ها ( Guard column) هاست. این پیش ستون ها آلودگی و موادی را که ممکن است در ابتدای ستون جذب شوند به خود جذب کرده و از صدمه دیدن ستون جلوگیری می‌کند. برای کارایی بهتر این پیش ستون ها میبایست نوع فاز ساکن به کار رفته در آن دقیقا مشابه فاز ساکن ستون مورد استفاده باشد در غیر این صورت نه تنها کارایی بهینه ای ندارد ، ممکن است در جداسازی ما تاثیر منفی نیز داشته باشد. 

به جز روش های فوق ، روش های دیگری نیز به کار می‌روند که معمولا چندان موثر نیستند. یکی از این روش ها ،  شستشوی ستون با حلال هایی است که بتواند این مواد جذب شده را شسته و از ستون خارج نماید. این روش معمولا توصیه نمی‌شود زیرا بسیاری از مواد جذب شده در بر روی فاز ساکن اگر از نوع پروتئین ها باشند ، ممکن است این پروتئین ها به مرور زمان در اثر Denaturing یا Cross-linking تغییر ماهیت داده باشند و با فاز ساکن واکنش داده باشند و با هرگونه حلال نیز حل نگردند. دومین دلیل آن است که با هر بار شستشو ، سبب شستن فاز پیوندی هیدرولیز شده که با فاز ساکن داخل ستون در تعامل است نیز می‌گردد. در نتیجه شستشوی مداوم سبب خارج شدن فاز پیوندی و کاهش عمر ستون می‌گردد. همچنین پس از شستشو ، لازم است که فاز ساکن در معرض فاز متحرک نیز قرار بگیرد تا دوباره به تعادل برسد و همین امر نیز مانند زمان استفاده از محلول های زوج یونی (Ion pairing reagents) در فاز متحرک زمان بر است و به نوبه خود سبب کوتاه شدن طول عمر ستون می‌گردد. 

روش دیگری که اغلب مورد استفاده قرار می‌گیرد ، شستشوی وارونه ی ستون (Column backflushing) است . در این مورد نیز اگر شستشو با یک حلال قوی صورت بگیرد ، همان مسائلی که  ذکر شد تکرار می‌شود اما اگر با فاز متحرک به شستشوی وارونه اقدام کنیم ، به دلیل بازداری بالای مواد جذب شده در ابتدای ستون ، باید زمان و حلال بسیار زیادی جهت پاک شدن این آلودگی ها صرف شود که ممکن است در آخر نیز نتیجه بخش نباشد. بنابراین تاکید می‌شود که  پیشگیری کردن و استفاده از پیش ستون و روش های ذکر شده بهترین روش  برای افزایش طول عمر ستون می‌باشد. 

یکی دیگر از دلایل کاهش طول عمر ستون ، استفاده از آن در pH های خارج از محدوده تعریف شده برای ستون توسط شرکت سازنده آن است . در این مورد نیز بهترین روش ، تغییر روش آنالیز نمونه است . بعضی مواقع ، ستون های خاصی هستند که مشکلات آن ها سبب کوتاه شدن طول عمرشان میگردد. به عنوان مثال ، ستون های آمینی با آلدئید ها و کتون ها واکنش می‌دهند. همچنین این ستون ها در حلال های آبی بافر نشده (Un-buffered aqueous solutions) ، محلول بازی قوی تشکیل می‌دهند که به حل شدن تدریجی فاز ساکن منجر می‌شود. 

نکته مهم دیگر این است ستون های HPLC در اثر تماس با یک حلال اشتباه ( غیر مجاز برای آن ستون ) دچار آسیب شدید می‌شوند. دلیل این امر این است که ستون های HPLC به طور اساسی دارای ساختار شکننده ای هستند که در اثر نوعی به هم چسبندگی ذره ها به یکدیگر شکل گرفته اند. به همین دلیل احتمال آسیب دیدگی این ذره ها از بستر شکل گرفته بسیار زیاد است. به عنوان مثال گاهی ستون های CN در مجاورت با حلال های با قطبیت متوسط و یا ستون های فنیل در تماس با THF دچار این نوع آسیب می‌شوند. خود این مساله دلیلی است که سراغ فرآیند شستشوی ستون نرویم . 

مشکل دیگری که معمولا در ستون های HPLC بوجود می‌آید ، گرفتگی فیلتر ورودی ستون است . این گرفتگی معمولا ناشی از ذرات موجود در فاز متحرک ، نمونه و یا ذره های تولید شده در اثر خوردگی قطعات پمپ و اینجکتور است. اگر این گرفتگی شامل بیشتر سطح فیلتر ورودی ستون باشد ، منجر به افزایش فشار ستون شده و عملا امکان کار با ستون را سلب می‌کند. حال اگر گرفتگی شامل بخشی از فریت (Frit)  ورودی ستون باشد ، مانند آچه در شکل 3-1 میبینید ، این امر می‌تواند منجر به پیک های تغییر شکل داده ( شکل 4-1) و یا دو شاخه شدن ( شکل 5-1 ) گردد. در این حالت می‌توان با تعویض فریت ورودی ستون (توسط کارشناس) مشکل را برطرف نمود. 

 

 

برای جلوگیری از گرفتگی فیلتر ورودی ستون ، معمولا استفاده از in-line-filter با فیلتر 2 میکرونی یا کمتر توصیه میشود. شکل 5-1 به عنوان نمونه این نوع فیلتر را نشان می‌دهد. همچنین فیلتر کردن نمونه با فیلتر های سرسرنگی و فیلتر کردن فاز متحرک شدیدا توصیه می‌گردد.